抗小鼠PD-1/PD-L1功能性抗体，从机制到体内实验设计

时间：2026-08-04 18:13:45 来源：搜狐

PD-1/PD-L1通路：免疫检查点的核心轴

程序性死亡受体-1（PD-1，CD279）由日本科学家本庶佑于1992年发现，属于CD28免疫球蛋白超家族成员，主要表达于活化T细胞、B细胞和NK细胞表面。其配体PD-L1（B7-H1，CD274）在抗原呈递细胞、肿瘤细胞及多种上皮细胞上均有表达。当PD-1与PD-L1结合后，通过招募SHP-2磷酸酶去磷酸化下游信号分子（如CD3ζ、ZAP70、CD28），抑制T细胞受体（TCR）和共刺激信号通路，导致T细胞增殖下降、细胞因子分泌减少、效应功能受损。

这一机制在正常生理中维持免疫耐受、防止自身免疫损伤。但肿瘤细胞高表达PD-L1，利用该通路逃逸免疫监视。阻断PD-1/PD-L1相互作用可恢复T细胞的抗肿瘤效应，这一策略已彻底改变了肿瘤治疗格局。2014年，首款PD-1抗体药物获批上市，截至目前全球已有超过1000项PD-1/PD-L1相关临床试验在推进。

小鼠模型：验证PD-1/PD-L1功能的关键体系

由于PD-1/PD-L1的种属特异性，针对人PD-1的抗体药物无法直接用于小鼠实验。基础研究中，抗小鼠PD-1和PD-L1的功能性抗体是解析该通路机制的必备工具，广泛应用于同基因移植瘤模型（如MC38结肠癌、B16-F10黑色素瘤、CT26结直肠癌）的体内治疗实验。

典型的实验方案为：荷瘤小鼠在肿瘤接种后第7-10天开始接受抗体治疗，通过腹腔注射给药，每次100-200 μg/只，每2-3天一次，持续2-3周。实验终点评估肿瘤生长曲线、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中CD8+ T细胞的比例和功能状态，以及荷瘤小鼠的生存期。

在体外实验中，PD-1/PD-L1功能性抗体用于阻断共培养体系中的免疫检查点信号，检测T细胞增殖（CFSE稀释法）、细胞因子分泌（ELISA/流式胞内染色）和靶细胞杀伤（LDH释放/实时细胞分析）等指标。

体内实验用抗体的关键指标

内毒素水平是体内实验用抗体的首要考量。内毒素通过TLR4/NF-κB通路激活固有免疫，诱导促炎因子释放，改变肿瘤微环境中免疫细胞的行为状态，直接干扰实验结果。体内注射用抗体的内毒素应低于1 EU/mg，高标准产品可达到0.001 EU/μg。

配方组成同样关键。常规流式抗体常含叠氮钠（防腐）和BSA（稳定剂），这些成分对小鼠具有毒性，不可用于体内注射。体内实验用抗体应为无载体蛋白（BSA-free）、无防腐剂（Azide-free）的PBS配方，经0.22 μm除菌过滤。

阻断活性决定了抗体能否有效竞争PD-1与PD-L1的结合。并非所有识别PD-1的抗体都具备阻断功能，功能性抗体需识别天然构象表位。克隆号RMP1-14（抗小鼠PD-1）和10F.9G2（抗小鼠PD-L1）是文献中广泛引用的体内阻断克隆，在多项肿瘤免疫研究中验证了阻断效力。

NeoMab® InVivo Prime Pro系列验证数据

信天翁生物旗下NeoMab®品牌推出的两款抗小鼠PD-1/PD-L1功能性抗体，均按体内实验标准设计和生产。

抗小鼠PD-1重组单克隆抗体（FM0002P），克隆号RMP1-14，Rat IgG2a/κ亚型。纯度>95%（SDS-PAGE），内毒素<0.001 EU/μg，PBS配方（pH 7.2），无载体蛋白无防腐剂。流式验证推荐浓度0.2 μg/mL。在荷瘤小鼠模型中，每只腹腔注射100 μg，肿瘤生长显著低于同型对照抗体组（Flu20），给药方案与主流文献一致。

抗小鼠PD-L1重组单克隆抗体（FM0001P），克隆号10F.9G2，Rat IgG2b/κ亚型。纯度>95%，内毒素<1 EU/mg，无载体蛋白配方。流式验证浓度0.2 μg/mL，Western Blot验证浓度10 μg/mL，在293F稳定转染小鼠PD-L1的细胞裂解液中检测到特异性条带，空载对照无信号。

两款抗体支持5 mg至100 mg多种规格，可定制。

研究机构应用反馈

上述两款抗体已在多家研究机构的体内实验中获得反馈验证。

PD-L1抗体（FM0001P）——山东大学齐鲁医院客户反馈

齐鲁医院研究人员采用小鼠肝脏成瘤模型，设对照组与PD-L1功能性抗体给药组（3次给药），评估该抗体的体内抑瘤活性。结果显示，与对照组相比，PD-L1给药组肿瘤组织明显缩小，验证了该PD-L1功能性抗体的体内抑瘤功能。

PD-1抗体（FM0002P）——复旦大学客户反馈

复旦大学研究人员采用C57小鼠皮下成瘤模型，设对照组与PD-1功能性抗体给药组，评估该抗体的体内抑瘤活性。结果显示，与对照组相比，PD-1给药组肿瘤生长受到抑制，验证了该PD-1功能性抗体的体内功能活性。

两项反馈均来自独立研究团队的体内实验，结合NeoMab®内部验证数据，进一步印证了RMP1-14和10F.9G2克隆在肿瘤免疫研究中的应用可靠性。

常见问题

Q：PD-1和PD-L1在免疫调控中的具体机制是什么？

PD-1是表达于活化T细胞表面的抑制性受体。当它与配体PD-L1结合后，招募SHP-2磷酸酶，去磷酸化TCR下游信号分子（CD3ζ、ZAP70等），抑制T细胞的增殖、细胞因子分泌和细胞毒活性。肿瘤细胞利用高表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合，使T细胞进入耗竭状态，实现免疫逃逸。阻断这一相互作用可恢复T细胞的抗肿瘤功能。

Q：抗PD-1和抗PD-L1治疗在机制上有什么区别？

抗PD-1抗体作用于T细胞端，阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，恢复T细胞功能。抗PD-L1抗体作用于肿瘤细胞或抗原呈递细胞端，阻断PD-L1与PD-1及CD80（B7-1）的结合。由于PD-L1还与CD80存在相互作用，抗PD-L1的阻断谱与抗PD-1不完全重叠，两者在免疫调控网络中的作用存在差异。在小鼠实验中，可根据研究目的选择单独使用或联合使用。

Q：小鼠PD-1体内实验的给药方案如何设计？

常用方案为肿瘤接种后7-10天开始给药，腹腔注射100-200 μg/只，每2-3天一次，持续2-3周。具体剂量和频次需根据肿瘤模型类型、生长速度和研究目的调整。对照组应使用同等剂量的同型抗体（Isotype control）。实验过程中定期测量肿瘤体积，终点评估肿瘤重量、TIL分析和生存期。

Q：体内实验为什么不能直接用流式抗体替代功能性抗体？

流式抗体的筛选标准是特异性结合靶标分子，不要求具备阻断活性。部分克隆虽然流式检测信号好，但识别的表位不在PD-1/PD-L1结合界面上，无法竞争性阻断受体-配体相互作用。此外，流式抗体常含叠氮钠和BSA，不适合体内注射。体内实验应选择经过功能验证的阻断型抗体，如RMP1-14和10F.9G2克隆。

Q：PD-1阻断实验中如何设置对照组？

对照组应包含同型抗体对照（Isotype control，与一抗相同亚型、相同剂量和给药方案），用于排除抗体Fc段非特异性效应的影响。条件允许时还应设置空白对照组（PBS注射）和阳性对照组（已知有效的抗PD-1抗体）。每组样本量一般不少于5-8只小鼠。

Q：检测小鼠肿瘤组织中PD-1/PD-L1表达常用哪些方法？

肿瘤浸润淋巴细胞的PD-1表达可通过流式细胞术检测，使用荧光标记的抗PD-1抗体（如clone RMP1-14）对消化后的肿瘤组织单细胞悬液进行染色。肿瘤细胞PD-L1表达可通过流式或免疫组化（IHC）检测。Western Blot可用于检测组织或细胞裂解液中PD-L1蛋白水平，但无法区分表达细胞类型。